a)
agar
bacteriológico;
b)
água destilada;
c)
extrato
de levadura;
d)
glicose;
e)
swab;
f)
filme de plástico;
g)
fita
crepe para autoclave;
h)
papel
alumínio;
i)
papel
pardo;
j)
penicilina
G (benzil penicilina);
k) placas
de Petri estéreis (80x15 mm);
l) rolhas
de algodão para erlenmeyers;
a) autoclave;
b) agitador
magnético com bailarina;
c) capela
de fluxo laminar;
d) balança
analítica e semi-analítica;
e) béqueres
de 100, 500, 1000 e 2.000
mL;
f)
erlenmeyers de 2.000, 1.000, 500, 250, 50 mL;
g)
pipetador
automático;
h)
proveta
de 500 mL;
i)
tubo
tipo falcon de 50 e 15 mL.
j)
bico
de bunsen
k)
alça
de platina
a) pesar
separadamente os reagentes abaixo em papel alumínio :
glicose.....................................................25g/L
extrato
de levedura...................................5g/L
agar
bacteriológico..................................20g/L
b) se for
necessário o preparo de quantidade maior ou menor de meio de cultura, os
valores devem ser multiplicados ou divididos proporcionalmente;
c) colocar
a glicose e o extrato de levedura pesados em um béquer de 1.000 mL e
acrescentar 500 mL de água destilada;
-
misturar os reagentes com uma
espátula;
-
introduzir uma bailarina
magnética no béquer, e homogeneizar no
agitador magnético;
d) Transferir
a solução para uma proveta e completar com água destilada até o meninsco
atingir a marca de 1.000 mL.
e) pesar
duas vezes 10 g de ágar bacteriológico e colocar em dois erlenmeyers de 1.000
mL;
f) com uma
proveta medir 500 mL do meio e colocar em cada um dos erlenmeyer de 1.000 mL;
g) agitar
levemente os erlenmeyers para a homogeneização do meio com o agar;
h) tampar
os frascos com rolha de algodão e papel alumínio ou papel pardo e colocar fita
para autoclave;
i) finalizado
o preparo de todos os meios, levá-los para a sala de autoclave para serem
autoclavados;
- alternativamente,
autoclavar pessoalmente os meios de cultura, a 120°C por 20 min, ao final da esterilização, desligar a autoclave, manter a
porta fechada até que a temperatura baixe e então retirar os frascos;
j) os meios
de cultura sólidos poderão ser vertidos assim que forem retirados da autoclave
ou dias depois;
k) em caso
de verter posteriormente os meios, manter no erlenmeyer, e armazenar em
temperatura ambiente sobre a bancada de meios de cultura devidamente
identificados com o nome do meio, nome de quem preparou e data de preparo;
-
prazo de validade é 90 dias;
-
caso o material apresente
mudança de cor, descartar;
-
para o plaqueamento posterior ao
armazenamento, aquecer o meio no microondas até que esteja completamente
dissolvido, e plaquear quando a temperatura do frasco seja suportável ao toque;
l) preparar
a capela:
-
limpar a área de trabalho com
álcool 70%;
-
ligar o fluxo e colocar um
pacote com 20 placas de Petri de 90x15 mm (estéreis) para cada erlenmeyer com
500 mL de meio;
-
acender a lâmpada UV e deixar
por 20 min
-
ao final da esterilização
apagar a lâmpada UV, acender a luz branca, retirar as placas de Petri do saco
plástico e empilhar;
m) colocar
na capela um erlenmeyer com o meio de cultura a ser vertido;
-
retirar a rolha e acrescentar
100 µL de
penicilina para cada 500 mL de meio.
-
verter o meio até a metade da
altura das placas;
-
ao finalizar, espalhar as
placas na superfície da capela, deixando as tampas das placas entreabertas;
n) decorridos
os 10 min,;
-
fechar as placas de Petri,
lacrando com filme plástico;
-
colocar as placas na estufa
30°C por
mínimo 48 h, empilhadas com as tampas voltadas para a superfície da estufa;
o) ao final
das 48 h, verificar em cada placa a presença de qualquer crescimento
microbiano;
-
descartar as placas que estejam
contaminadas;
-
constatada a ausência de
contaminação, guardar na geladeira até a sua utilização;
-
as placas devem ser
empilhadas invertidas, identificadas com o nome do meio e do responsável pelo
preparo e a data;
-
se apresentar algum tipo de
contaminação, descartar apenas as placas contaminadas.
2.2 Isolamento de Fungos
a)
Coletar o material com swab
estéril de qualquer superficie desejada para estudo.
b)
Passar o swab em solução
salina a 0.9% e semear no meio de cultura sólido previamente preparado.
c)
Colocar as placas semeadas na
estufa a 37°C pelo período de 7 a 10 dias.
d)
Após o período de encubação,
observar se houve crescimento efetivo de fungos.
-
descartar as placas que tenham contaminantes, como leveduras e bactérias, em
grande quantidade.
e)
O processo de repique deve
ser realizado em uma capela de fluxo lâminar.
f)
Preparar a capela de fluxo
lâminar:
-
limpar a área de trabalho com
álcool 70%;
-
ligar o fluxo e colocar as
placas de Petri (estéreis) com o meio;
-
acender a lâmpada UV e deixar
por 20 min
-
ao final da esterilização
apagar a lâmpada UV, acender a luz branca, ligar o bico de bunsen, colocar as
placas a serem semeadas e as já cultivadas .
g)
Isolamento de fungos:
- flambar
a alça de platina e esperar esfriar
- em
seguida coletar a cepa de fungo desejado, de preferência escolher uma colônia
que encontra-se mais isolada, e semear em uma nova placa.
-
repetir os passos anteriores para cada cepa de fungo encontrada.
-
encubar as placas semeadas na estufa a uma temperatura de 37ºC pelo período de 7 a 10
dias.
- após o
período de encubação caso ainda houver crescimento de duas ou mais espécies de
fungos na mesma placa, repetir o procedimento, até que se obtenha o crescimento
puro de uma espécie.
h)
Após crescimento armazenar as
placas na geladeira.
