Preparo de meio de cultura YG líquido com amido e crescimento de fungo em meio líquido

1.  Materiais utilizados

a)    água destilada;

b)    extrato de levadura;

c)    amido;

d)    glicose;

e)    filme de plástico;

f)     fita crepe para autoclave;

g)    papel alumínio;

h)    papel pardo;

i)     penicilina G (benzil penicilina);

j)     rolhas de algodão para erlenmeyers;

1.2 Equipamentos e utensílios

a)    capela de fluxo lâminar;

b)    mesa agitadora;

c)    autoclave;

d)    agitador magnético com bailarina;

e)    balança analítica e semi-analítica;

f)     alça de inoculação estéril descartável 10µL

g)    béqueres de 100, 500, 1000 e 2.000 mL;

h)    erlenmeyers de 2.000, 1.000, 500, 250, 50 mL;

i)     pipetador automático;

j)     proveta de 500 mL;

k)    bico de bunsen

2  METODOLOGIA

2.1      Preparo de meio de cultura YG líquido com amido

a)    pesar separadamente os reagentes abaixo em papel alumínio :

glicose.....................................................12,5g/500mL

extrato de levedura...................................2,5g/500mL

amido......................................................2,5g/500mL

b)    se for necessário o preparo de quantidade maior ou menor de meio de cultura, os valores devem ser multiplicados ou divididos proporcionalmente;

c)    colocar a glicose e o extrato de levedura  pesados em um béquer de 1.000 mL e acrescentar 250 mL de água destilada;

-          misturar os reagentes com uma espátula;

-          introduzir uma bailarina magnética  no béquer, e homogeneizar no agitador magnético;

d)    Transferir a solução para uma proveta e completar com água destilada até o meninsco atingir a marca de 500 mL;

e)    Separar 10 erlenmeyers de 250 mL e acrescentar 0,25g de amido em cada, totalizando 2,5g.

f)     Em seguida transferir 50ml da solução em cada erlenmeyer de 250 mL com amido;

g)    agitar levemente os erlenmeyers para a homogeneização do meio com amido;

h)    tampar os frascos com rolha de algodão e papel alumínio ou papel pardo e colocar fita para autoclave;

i)     finalizado o preparo de todos os meios, levá-los para a sala de autoclave para serem autoclavados;

-   alternativamente, autoclavar pessoalmente os meios de cultura, a 120°C por 20 min, ao final da esterilização, desligar a autoclave, manter a porta fechada até que a temperatura baixe e então retirar os frascos;

-      prazo de validade é 90 dias;

-      caso o material apresente mudança de cor, descartar;

j)     Armazenar na geladeira.

2.2      Crescimento de fungos em meio líquido

a)    Esse procedimento deve ser realizado em uma capela de fluxo lâminar

b)    preparar a capela:

-      limpar a área de trabalho com álcool 70%;

-      ligar o fluxo e colocar os erlenmeyers contendo meio YG líquido com amido, previamente preparado.

-      acender a lâmpada UV e deixar por 20 min

-      ao final da esterilização apagar a lâmpada UV, acender a luz branca, retirar o papel pardo e as rolhas dos erlenmeyers;

c)    Pegar os fungos, que foram previamente isolados e armazenados, a serem inoculados no meio.

d)    Com o auxílio de uma alça de inoculação estéril descartável cortar de 3 a 4 colônias do fungo juntamente com o meio de cultura e inocular no meio líquido.

e)    Descartar a alça de inoculação e tampar com a rolha de algodão o erlenmeyer.

f)     Repetir os passos 3.2.2 “d” e “e” para as outras espécies de fungos.

g)    Colocar os erlenmeyers inoculados em uma mesa agitadora e observar crescimento após um período de 5 a 7 dias.