Eletroforese

1 Materiais utilizados

a)    tampão de eletroforese (Tris-acetato-EDTA - TAE ou Tris-borato-EDTA - TBE);

b)    tampão de corrida (Migração: azul de bromofenol - 300bp e xileno cianol - 4000bp);

c)    brometo de etídeo;

1.2 Equipamentos e utensílios

a)    cuba de eletroforese;

b)    fonte de força;

c)    bandejas de gel (diferentes tamanhos e de plástico transparente à UV);

d)    pentes (para fazer poços);

e)    transiluminador;

f)     pipetas de precisão;

g)    béqueres de 500 mL;

h)    erlenmeyers de 500 mL;

i)     pipetador automático;

2 METODOLOGIA

2.1 Preparo de gel de agarose (0,8%)

a)    Para 100 mL de gel, pesar:

agarose........................8 g

b)    adicionar 100mL de TAE 1X;

c)    fundir a solução no microondas até homogeneizar (aproximadamente 1 min e 10 seg na potência máxima – evitar fervura);

d)    enquanto a solução de gel esfria (morno), preparar o suporte de gel, selando as laterais com fita crepe ou na própria cuba;

e)    acrescentar 4µL de Brometo de Etídeo (10mg/mL) e misturar com agitação leve;

obs.: brometo de etídio é mutagênico e deve ser manuseado com luvas.

f)     despejar a solução de gel no suporte sem fazer bolhas;

g)    colocar o pente da espessura desejada no suporte;

obs.: verificar o número e o volume das amostras para escolher o pente mais adequado.

h)    esperar a solução solidificar;

i)     colocar o suporte com o gel na cuba de eletroforese;

j)     adicionar tampão TAE 1X até cobrir a superfície do gel.

2.2 Analítica

k)    extrair 3µL da amostra de DNA;

l)     homogeinizar com 1µL de tampão de corrida 5X (Loading Buffer);

m)  aplicar as amostras nos poços;

n)    reservar 2 poços para utilização de um padrão de corrida (Ladder-1Kb);

o)    ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (média utilizada 80V);

p)    analisar o gel sob radiação ultravioleta (Alpha Imager);

q)    tirar foto dos resultados obtidos;

2.3 Preparativa

r)     adicionar tampão de corrida ao material a ser purificado (diluição de 5X);

s)    aplicar as amostras nos poços, pulando um poço entre cada amostra para evitar contaminação;

obs.: para volumes maiores, montar o gel com o pente de dentes largos ou unir os dentes do pente com fita adesiva antes de colocar o pente no gel ainda líquido (morno).

t)     aplicar em outro poço o padrão de tamanho molecular (Ladder-1kb);

u)    ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (média utilizada 80V);

v)    vizualizar as bandas no gel utilizando a luz ultravioleta manual no comprimento de onda longo;

w)   cortar a banda desejada utilizando bisturi limpo e colocá-la em um tubo de microcentrífuga previamente pesado;

x)    seguir protocolo de Purificação de DNA a partir de Gel.

2.4 Soluções

y)    Tampão de corrida

Solução TAE 1X (Tampão Tris-Acetate - Tris 40mM, Ac. Acetico 20mM,EDTA 1mM)

diluir a solução estoque 50x em água Milli-Q.

z)    TAE 50X

(Solução estoque)            p/ 1L

Trizma-Base                    242,0g

Ácido acético glacial        57,1mL

EDTA 0.5M pH 8.0          100,0mL

água q.s.p.                       1000,0mL

aa)  Tampão de amostra 5X

(Loading Buffer)                          p/ 50mL

Glicerol (50%)                              25,0mL

Azul de Bromofenol (0.125%)     0,0625g

Xileno Cianol (0.125%)                0,0625g

TE pH8,0 q.s.p.                            50,0mL

bb)  Padrão de tamanho molecular

(Ladder-1kb)                                                                               (0,1µg/µL)

Ladder 1kb (Gibco BRL - 1µg/µL)                                              100µL

Tampão (Tris 10mM pH7,5, NaCl 50mM, EDTA 0,1mM)        500µL

Loading Buffer 5X                                                                      400µL

cc) Brometo de etídeo (10mg/mL)

Brometo de etídeo                                   1g

Água Milli-Q q.s.p.                                   100mL

Agitar durante 16 horas, guardar a 4°C.

obs.: concentração no gel: 5µg/mL