Extração de DNA fúngico

1 Materiais utilizados

a)     Solução tampão;

b)     Fenol;

c)     Etanol

d)     Salina;

1.2 Equipamentos e utensílios

a)     Filtro à vácuo;

b)     Papel de filtro;

c)     Papel alumínio;

d)     Eppendorf;

e)     Vórtex;

f)       Centrífuga.

2. Extração de DNA

  2.1     Filtrar o fungo do meio YG líquido

- Filtrar o meio de cultura YG com fungos anteriormente preparados, que estejam sem contaminação e com bom crescimento.

- A filtragem é feita com bomba de vácuo com uso de papel de filtro.

  2.2     Armazenamento

- Após a filtragem, os fungos que permanecem no papel filtro  devem ser armazenados em envelopes de papel alumínio identificados.

- Colocamos os envelopes de alumínio em uma placa de petri, embalamos a placa com papel filme e levamos ao freezer por uma semana, para garantir o congelamento total do até a extração do DNA.

- Retiramos a placa de petri do freezer e deixamos em temperatura ambiente por alguns minutos para facilitar o corte.

  2.3     Extração do DNA

- Abrimos o envelope de papel laminado e com uma lâmina de bisturi, nova, estéril cortamos uma amostra da massa de fungo e colocamos em um eppendorf de 1.5ml até mais ou menos a marca 0.5ml.

- Ao eppendorf deve ser adicionado 500 µL de tampão e 500 µL de fenol;

- O fungo deve ser lacerado e depois levado ao vórtex e logo depois à centrífuga a 10.00 rpm por 10 minutos;

- O sobrenadante deve ser retirado e colocado e um outro eppendorf;

- Acrescentar mais 500 µL de fenol e levar a centrífuga novamente por mais 10 minutos;

- Retirar o sobrenadante e passar para outro eppendorf;

- Acrescentar 40 µL de etanol e completar até 1 mL com salina;

- Guardar os tubos eppendorf sob refrigeração.

- No momento de usar o DNA já extraído para uma nova etapa:

- Colocar os tubos eppendorf na centrífuga a 10.000 rpm por 10 minutos;

- Lavar 2 x com álcool 70% sem retirar o sobrenadante;

- Retirar todo o álcool e deixar secar a temperatura ambiente;

- Depois de seco, resuspender com água destilada (100 µL);

- Retirar 20 µL do sobrenadante e passar para outro eppendorf;

- Acrescentar 10 µL de tampão com corante.