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Técnica de amplificação in vitro que pode amplificar sequências
especiíficas de DNA intacto ou fragmentado.
Baseia-se em um ciclo repetitivo de três reações, desnaturação,
anelamento e amplificação do DNA, que ocorrem em diferentes temperaturas.
Desnaturação: temperatura aprox. 94ºC. Separação da dupla fita de DNA
pelo rompimento das pontes de hidrogênio.
Anelamento: temperatura aprox. 54ºC. Ligação do primers foward e reverse
às fitas de DNA.
Amplificação: temperatura aprox. 60 – 70 ºC. Ligação da Taq DNA
polimerase e extensão das fitas de DNA pela adição de nucleotídeos nas
extremidades 5’ livres.
Para o sequenciamento os dideoxinucleotídios marcados com fluoróforos
são detectados ao término de cada ciclo.
A PCR tempo real requer um termociclador com um sistema óptico para a
excitação da fluorescência e um computador para coleta e análise de dados.
A partir deste método, a quantificação de DNA ou RNA pode ser feita de
maneira mais precisa e com maior reprodutibilidade.
KITS
SYBR® Green se liga entre as fitas duplas de DNA.
Vantagens: baixo custo, facilidade de uso e sensibilidade.
Desvantagens: inespecífico para o fragmento alvo, pois liga-se em toda
região pareada.
TaqMan ® é um método sensível que consiste em determinar presença ou
ausência de sequências específicas.
É uma sonda que se liga na região alvo do DNA fita simples que contém
uma extremidade fluorescente (F) e um extremidade quencher (Q).
Quando a polimerase sintetiza a segunda fita, quebra essa sonda
liberando a fluorescência.
Referência
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