Preparo de meio YG sólido e isolamento de fungo.

1.  Materiais utilizados

a)    agar bacteriológico;

b)    água destilada;

c)    extrato de levadura;

d)    glicose;

e)    swab;

f)     filme de plástico;

g)    fita crepe para autoclave;

h)    papel alumínio;

i)     papel pardo;

j)     penicilina G (benzil penicilina);

k)    placas de Petri estéreis (80x15 mm);

l)     rolhas de algodão para erlenmeyers;

1.2 Equipamentos e utensílios

a)    autoclave;

b)    agitador magnético com bailarina;

c)    capela de fluxo laminar;

d)    balança analítica e semi-analítica;

e)    béqueres de 100, 500, 1000 e 2.000 mL;

f)     erlenmeyers de 2.000, 1.000, 500, 250, 50 mL;

g)    pipetador automático;

h)    proveta de 500 mL;

i)     tubo tipo falcon de 50 e 15 mL.

j)     bico de bunsen

k)    alça de platina

2  METODOLOGIA

2.1      Preparo de meio de cultura YG sólido

a)    pesar separadamente os reagentes abaixo em papel alumínio :

glicose.....................................................25g/L

extrato de levedura...................................5g/L

agar bacteriológico..................................20g/L

b)    se for necessário o preparo de quantidade maior ou menor de meio de cultura, os valores devem ser multiplicados ou divididos proporcionalmente;

c)    colocar a glicose e o extrato de levedura pesados em um béquer de 1.000 mL e acrescentar 500 mL de água destilada;

-          misturar os reagentes com uma espátula;

-          introduzir uma bailarina magnética  no béquer, e homogeneizar no agitador magnético;

d)    Transferir a solução para uma proveta e completar com água destilada até o meninsco atingir a marca de 1.000 mL.

e)    pesar duas vezes 10 g de ágar bacteriológico e colocar em dois erlenmeyers de 1.000 mL;

f)     com uma proveta medir 500 mL do meio e colocar em cada um dos erlenmeyer de 1.000 mL;

g)    agitar levemente os erlenmeyers para a homogeneização do meio com o agar;

h)    tampar os frascos com rolha de algodão e papel alumínio ou papel pardo e colocar fita para autoclave;

i)     finalizado o preparo de todos os meios, levá-los para a sala de autoclave para serem autoclavados;

-   alternativamente, autoclavar pessoalmente os meios de cultura, a 120°C por 20 min, ao final da esterilização, desligar a autoclave, manter a porta fechada até que a temperatura baixe e então retirar os frascos;

j)     os meios de cultura sólidos poderão ser vertidos assim que forem retirados da autoclave ou dias depois;

k)    em caso de verter posteriormente os meios, manter no erlenmeyer, e armazenar em temperatura ambiente sobre a bancada de meios de cultura devidamente identificados com o nome do meio, nome de quem preparou e data de preparo;

-      prazo de validade é 90 dias;

-      caso o material apresente mudança de cor, descartar;

-      para o plaqueamento posterior ao armazenamento, aquecer o meio no microondas até que esteja completamente dissolvido, e plaquear quando a temperatura do frasco seja suportável ao toque;

l)     preparar a capela:

-      limpar a área de trabalho com álcool 70%;

-      ligar o fluxo e colocar um pacote com 20 placas de Petri de 90x15 mm (estéreis) para cada erlenmeyer com 500 mL de meio;

-      acender a lâmpada UV e deixar por 20 min

-      ao final da esterilização apagar a lâmpada UV, acender a luz branca, retirar as placas de Petri do saco plástico e empilhar;

m)  colocar na capela um erlenmeyer com o meio de cultura a ser vertido;

-          retirar a rolha e acrescentar 100 µL de penicilina para cada 500 mL de meio.

-          verter o meio até a metade da altura das placas;

-          ao finalizar, espalhar as placas na superfície da capela, deixando as tampas das placas entreabertas;

n)    decorridos os 10 min,;

-          fechar as placas de Petri, lacrando com filme plástico;

-          colocar as placas na estufa 30°C por mínimo 48 h, empilhadas com as tampas voltadas para a superfície da estufa;

o)    ao final das 48 h, verificar em cada placa a presença de qualquer crescimento microbiano;

-          descartar as placas que estejam contaminadas;

-          constatada a ausência de contaminação, guardar na geladeira até a sua utilização;

-          as placas devem ser empilhadas invertidas, identificadas com o nome do meio e do responsável pelo preparo e a data;

-          se apresentar algum tipo de contaminação, descartar apenas as placas contaminadas.

2.2  Isolamento de Fungos    

a)    Coletar o material com swab estéril de qualquer superficie desejada para estudo.

b)    Passar o swab em solução salina a 0.9% e semear no meio de cultura sólido previamente preparado.

c)    Colocar as placas semeadas na estufa a 37°C pelo período de 7 a 10 dias.

d)    Após o período de encubação, observar se houve crescimento efetivo de fungos.

- descartar as placas que tenham contaminantes, como leveduras e bactérias, em grande quantidade.

e)    O processo de repique deve ser realizado em uma capela de fluxo lâminar.

f)     Preparar a capela de fluxo lâminar:

-      limpar a área de trabalho com álcool 70%;

-      ligar o fluxo e colocar as placas de Petri (estéreis) com o meio;

-      acender a lâmpada UV e deixar por 20 min

-      ao final da esterilização apagar a lâmpada UV, acender a luz branca, ligar o bico de bunsen, colocar as placas a serem semeadas e as já cultivadas .

g)    Isolamento de fungos:

- flambar a alça de platina e esperar esfriar

- em seguida coletar a cepa de fungo desejado, de preferência escolher uma colônia que encontra-se mais isolada, e semear em uma nova placa.

- repetir os passos anteriores para cada cepa de fungo encontrada.

     

- encubar as placas semeadas na estufa a uma temperatura de 37ºC pelo período de 7 a 10 dias.

- após o período de encubação caso ainda houver crescimento de duas ou mais espécies de fungos na mesma placa, repetir o procedimento, até que se obtenha o crescimento puro de uma espécie.

h)    Após crescimento armazenar as placas na geladeira.