- O
seqüenciamento da plataforma Solexa é realizado por síntese usando DNA
polimerase e nucleotídeos terminadores marcados com diferentes
flouróforos.
- A
inovação dessa plataforma consiste na clonagem in vitro dos
fragmentos em uma plataforma sólida de vidro (PCR de fase sólida).
- A superfície de clonagem (flow cells) é
dividida em oito linhas podendo ser feito o seqüenciamento de até oito
bibliotecas.
- Os
fragmentos de DNA da amostra são ligados a adaptadores em ambas as
extremidades, o que permitem a sua fixação aos adaptadores fixados á
superfície da flow cell pela extremidade 5’ , deixando a
extremidade 3’ livre para servir na iniciação da reação de seqüenciamento.
- No
primeiro ciclo de amplificação, nucleotídeos não marcados são fornecidos
para que haja a síntese da segunda fita do fragmento imobilizado no
suporte.
- Após
o ciclo de anelamento o fragmento forma uma estrutura em “ponte” na
superfície de sequenciamento e a extensão ocorre, formando a fita
complementar também em “ponte”.
- No ciclo de desnaturação, as fitas são separadas e linearizadas.
- Esses ciclos são repetidos cerca de 35 vezes e assim cerca de mil copias geradas de cada fragmento nessa PCR de fase sólida permanecem próximas umas das outras, formando um cluster de sequenciamento.
- Etapas
de desnaturação são necessárias para a separação dos duplex formados e,
nos próximos ciclos de amplificação, nucleotídeos terminadores marcadores
são fornecidos para as reações de sequenciamento que ocorrem dentro de
cada cluster.
- A
alta densidade dos clusters de sequenciamento possibilita que o sinal de
fluorescência gerado com a incorporação de cada um dos nucleotídeos
terminadores tenha uma intensidade suficiente para garantir sua detecção
exata.
- Após
a incorporação de cada nucleotídeo no fragmento em síntese, a leitura do
sinal de fluorescência é realizada.
- Em seguida, ocorre uma etapa de lavagem para remoção dos reagentes excedentes e remoção do terminal 3’ bloqueado e do fluoróforo do nucleotídeo incorporado no ciclo anterior para que a reação de sequenciamento prossiga.
- A
leitura das bases é feita pela análise sequencial das imagens capturadas
em cada ciclo de sequenciamento. Leituras de 25-35 bases são obtidas de
cada cluster.
Vídeo Youtube
Referência
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