O diagnóstico clínico é
difícil de ser realizado principalmente na fase aguda da doença em que os
sintomas são muito similares aos de outras infecções febris agudas, ficando a
cargo do laboratório o diagnóstico definitivo.
Os métodos sorológicos para
detecção de anticorpos IgM/IgG são os mais amplamente utilizados, mas
inadequados para diagnóstico precoce uma vez que detectam anticorpos a partir
do sexto dia do início dos sintomas. Os métodos moleculares estão sendo cada vez
mais utilizados para o diagnóstico precoce por serem mais rápidos e sensíveis
que a sorologia e o isolamento viral.
As técnicas moleculares,
cujo objetivo é a detecção do genoma viral, têm importante papel no diagnóstico
da dengue uma vez que são capazes de identificar o vírus na fase aguda da
doença e, em algumas metodologias, quantificar a carga viral.
Entre os métodos mais
utilizados podemos citar a hibridização e a transcrição reversa combinada à
reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) convencional e em tempo real. A hibridização
de ácidos nucléicos é aplicável tanto para amostras clínicas quanto para
tecidos fixados provenientes de biopsias ou autopsias. Devido sua complexidade
técnica, a hibridização é de difícil aplicação na rotina sendo mais utilizada
como ferramenta de pesquisa.
A RT-PCR convencional é um
método que possibilita a amplificação de sequências genômicas específicas de
RNA delimitadas por iniciadores (primers). A aplicação de técnicas de
fluorescência à RT-PCR, juntamente com instrumentação adequada, capaz de
combinar amplificação, detecção e quantificação levou ao desenvolvimento de uma
variação deste método denominado RT-PCR em tempo real.
A RT- PCR em tempo real, assim como a convencional, possibilita a
amplificação de fragmentos genômicos, contudo a detecção dos produtos é feita
diretamente na plataforma de instrumentação, utilizando marcadores
fluorescentes e métodos sensíveis de mensuração da fluorescência emitida. O
método não requer manipulação após a amplificação, sendo por isso chamado de
sistema fechado ou homogêneo. As principais vantagens deste sistema homogêneo
são: redução do tempo necessário para a realização do teste e baixo risco de
contaminação com o produto amplificado, além disso, este método permite a
quantificação da carga viral por comparação com uma curva padrão.
Durante a fase exponencial
de amplificação é possível determinar um valor de intensidade de fluorescência,
no qual todas as amostras podem ser comparadas. Este valor é denominado
threshold ou limiar e é calculado em função da quantidade de fluorescência
basal (background). Neste ponto, o sinal de fluorescência gerado por cada
amostra é significativamente maior que a fluorescência basal.
A quantidade de ciclos de
PCR requerida para que cada amostra emita fluorescência suficiente para
alcançar este limiar pré-estabelecido é chamado de cycle threshold (Ct), o qual
é inversamente proporcional à quantidade inicial do alvo presente na reação. A
fluorescência emitida é captada pelo sistema óptico do termociclador e transmitida
para um computador onde o software faz a análise final dos dados. A RT-PCR em tempo real apresenta
sensibilidade maior que o isolamento e a RT-PCR convencional e equivalente à
nested RT-PCR convencional. Várias estratégias de marcação vêm sendo utilizadas
para detecção do fragmento amplificado, algumas usam substâncias fluorescentes
que se ligam ao DNA dupla fita como SYBR green, e outros usam sondas marcadas.
As estratégias que utilizam
sondas marcadas são altamente sensíveis e específicas. As três metodologias
mais utilizadas são ensaio fluorogênico da atividade 5’nuclease (TaqMan®),
sonda de hibridação molecular beacons (oligonucleotídeos que formam uma
estrutura secundária entre as extremidades 5’ e 3’) e sonda de hibridação FRET
(fluorescence resonance energy transfer). Estas sondas são desenhadas com base
na sequência do fragmento alvo a ser amplificado e contêm um corante
fluorescente ligado ao seu terminal 5’ (reporter) e um inibidor da
fluorescência (quencher) ligado ao seu terminal 3’. Durante o processo de
amplificação a sonda se liga a uma região específica do produto amplificado. Após
a hibridação o reporter e o quencher são separados ocorrendo assim a
emissão de fluorescência que é diretamente proporcional à quantidade do DNA
alvo presente na amostra.
Trabalhos usando TaqMan® descrevem sua capacidade de detectar e
quantificar a carga viral por RT-PCR numa única etapa. Porém, a grande
desvantagem das estratégias que utilizam sondas marcadas é o seu elevado custo.
As estratégias que utilizam fluoróforos como o SYBR Green são baseadas
na ligação deste corante com o DNA de dupla fita amplificado na reação, o que
garante sua sensibilidade, mas com uma especificidade inferior ao daqueles que
usam sondas marcadas.
A especificidade do produto
amplificado é determinada pela análise da curva de dissociação, a qual permite
calcular a temperatura de desnaturação (temperatura de melting - Tm) do produto
amplificado que depende do tamanho e da sequência da mesma.
Um grupo de pesquisa
descreveu recentemente uma RT-PCR, com base no SYBR Green, simples e altamente
sensível para detecção gênero específica do vírus da dengue. Considerando que
existem quatro sorotipos do vírus da dengue, é de suma importância,
principalmente do ponto de vista epidemiológico, a tipificação do vírus
circulante. Chutinimitkul et al. (2005),
desenvolveram um método de RT-PCR em tempo real, baseado no SYBR Green, capaz
de detectar o sorotipo viral, porém tal método é realizado em duas etapas,
síntese de cDNA seguida de PCR em tempo real o que torna mais laborioso seu uso
na rotina. O problema de se realizar
duas etapas foi eliminado na RT-PCR em uma única etapa realizada por Chien et
al. (2006) e Shu et al. (2003). Entretanto, apesar de realizarem o ensaio em
uma única etapa, detectam em um tubo de reação apenas o sorogrupo dengue,
enquanto que outros quatro tubos devem ser utilizados para determinar os
sorotipos. Este problema foi minimizado por Yong et al. (2007) que
desenvolveram uma RT-PCR em tempo real com SYBR Green com primers para os
quatro sorotipos em uma única etapa em um único tubo de reação.
A vantagem do uso do SYBR Green em lugar da sonda marcada é o menor
custo. Demonstrou-se que o uso do SYBR Green reduziu os custos com o
diagnóstico em cerca da metade quando comparado com outros métodos que usam
sondas.
Desenho dos primers
Os primers para
detecção específica dos sorotipos foram desenhados com base na extremidade 5’
do genoma viral. Os primeiros nucleotídeos desta extremidade são altamente
conservados entre os quatro sorotipos, por este motivo, optou-se por utilizar como primer sense o 5 ́UTR-S (5’-AGT TGT TAG TCT
ACG TGG ACC GA-3’) que reconhece os primeiros 23 nucleotídeos dos quatro
sorotipos. Os primers complementares,
específicos para cada sorotipo, foram
desenhados com base na região localizada entre os nucleotídeos 303 e 791, a
qual é variável entre os sorotipos. Para isto, foram comparadas sequências
nucleotídicas correspondentes a vírus representativos dos quatro sorotipos depositadas
na base de dados do GenBank.
RT-PCR em tempo real em única etapa
A mistura de reação continha:
- ·
12,5μl 2X SYBR green,
- ·
0,5μl SuperScriptTM III RT/Platinum® Taq Mix,
- ·
5μl de RNA,
- ·
0,2μM, 0,4μM ou 0,6μM do primer FG1 e de cada um dos primers sorotipo
específicos para dengue (separados ou juntos em um único tubo) ;
- ·
água destilada livre de DNase/RNase até volume final de 25μl.
A amplificação foi realizada a 50oC
por 1200 segundos (RT), seguida de uma incubação de 95oC por 300
segundos e 45 ciclos de 95oC por 15 segundos, 50 a 60oC por
40 segundos e 72oC por 30 segundos (PCR).
Para determinar a especificidade do produto
amplificado foi calculada a temperatura de melting (Tm) através da análise da
curva de dissociação. Os produtos obtidos foram submetidos à eletroforese em
gel de agarose 1,8% para confirmação do tamanho.
Resultados
A especificidade de cada primer foi avaliada
testando os mesmos contra sorotipos virais diferentes daqueles para os quais
foram desenhados.
Aqueles primers que amplificaram o genoma de
outro sorotipo, apresentando Tm similar àquela do próprio sorotipo, foram
considerados inespecíficos.
